【獸藥名稱】

通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光 PCR 檢測試劑盒（B 盒）

漢語拼音：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英文名稱：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

商品名稱：無

【作用與用途】

用于血液、血球粉、淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

【用法與判定】

1.用法

1.1 樣品處理

血液樣品直接用；淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品 2.0g 于研缽中充分研磨，再加 10.0mL PBS（pH7.2，含 1 萬單位青霉素和 1 萬單位鏈霉素）混勻（樣品不足 2.0g 按 1:5 比例加 PBS），對處理的待檢樣品置 70℃，30 分鐘滅活后，3000r/min，4℃離心 5 分鐘，取上清液，編號備用；血球粉處理同上，只不過省掉研磨步驟。

1.2 樣品存放

采集或處理好的樣品在 2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過 24h；若需長期保存，須放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過 3 次）。

1.3 操作步驟

1.3.1 病毒 DNA 的提取

病毒 DNA 的提取推薦使用本公司生產(chǎn)的非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測試劑盒（A 盒），操作步驟參照說明書。如客戶自備提取試劑，請參考相應(yīng)提取試劑的使用說明書進(jìn)行操。提取好的 DNA 須在 2h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，若需長期保存須放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.3.2 熒光 PCR 擴(kuò)增（使用 B 盒）

（1）從試劑盒中取出熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，室溫融化后，2000r/min 離心 5 秒。設(shè)所需 PCR 管數(shù)為 n（n=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系需要 20μL 熒光PCR 反應(yīng)液和 0.5μL Taq 酶。計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積小管中，充分混合均勻后，向每個 PCR 管中各分裝20μL。

（2）分別向上述 PCR 管中加入 1.3.1 中制備的 DNA 溶液各5μL，蓋緊管蓋，500r/min 離心 30 秒。

（3）將加樣后的 PCR 管放入熒光 PCR 檢測儀內(nèi)，作好標(biāo)記。

反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：

第一階段，預(yù)變性 95℃/3 分鐘

第二階段，95℃/10 秒，60℃/30 秒共 45 個循環(huán)。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的 60℃延伸時進(jìn)行。

2.判定

2.1 結(jié)果分析條件的設(shè)定

閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對照品擴(kuò)增曲線的最高點為準(zhǔn)。對于多通道熒光 PCR 儀，選定 FAM（465-510）檢測通道讀取檢測結(jié)果，ABI 儀器選擇FAM 無熒光淬滅基團(tuán)。

2.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1 陰性對照無 Ct 值并且無擴(kuò)增曲線。

2.2.2 陽性對照的 Ct 值應(yīng)≤28，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

2.2.3 如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實驗視為無效。

2.3 結(jié)果判定

2.3.1 陰性：無 Ct 值，且無特征性擴(kuò)增曲線，表明樣品為陰性。

2.3.2 陽性：Ct 值≤38.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品為陽性。

2.3.3Ct 值＞38.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品建議復(fù)驗。復(fù)驗仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，判為陽性，否則判為陰性。

批準(zhǔn)文號:獸藥生字191478858